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合成问题

发布时间:2014年06月12日发布人:乐彩客生物技术关注度:3831

 

1.纯化方式及其详细说明

纯化方式 详细说明
脱盐(DSL) 合成完成的寡核苷酸通过高纯氨气混合水蒸汽,在高温高压下将连接在CPG上的app切下来后通过普通相层析柱进行层析除盐。
Cartrige纯化 Cartrige纯化是通过反相净化介质 (Reverse Phase Cartridge) 对app进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,Cartrige是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护乐彩客和短的app片段从反相柱上洗掉。
PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对appDNA进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。
HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对appDNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在appDNA的分析和纯化中,常用的是反相(reverse-phase)HPLC。reverse phase HPLC:纯度大于90%; HPLC纯化主要用于修饰app的纯化。该法的缺点是成本较高,批量生产效率不高。

2.如何测定app的OD值?    

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。

举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

3.怎样溶解app?

我们的的合成报告单给出了每ODapp稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟,防止开盖时app散失。

4.合成的app应如何保存?

没有溶解的app非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的app可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmol/ml或20 pmol/ml)后进行实验。

5.如何检测app的纯度?

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的app用20%的胶,12-60个碱基的app用16%的胶,>60个碱基的app用12%的胶,取0.2OD左右的app,用尿素饱和液溶解或app溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加乐彩客比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是app二级结构条带)。

6.一般的合成的app在5'和3'末端有磷酸乐彩客吗?

没有,5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸乐彩客,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。

7.合成的app进行PCR反应时无目的带,怎么办?

PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。
1) app和模板是否配对,同源性有多大?
2) app本身是否有立体结构.
3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
4) PCR仪是否工作正常?
5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成app。

8.测定了app的OD值后发现A260/A280<1.8,app的纯度合格吗?

由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的app的A260/A280比值也不同, 例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断app的纯度.

9.如何将两条互补的单链退火形成双链?

用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的app可以多少做次PCR反应? 一般来讲,20个碱基左右的2OD的app最少可以做400次PCR反应。 EDTA)溶解app, 将要退火的app等摩尔数混合,总体积不要超过500微升,加热到95℃ 2mins,然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

10.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的app,发现有很多条泳带,为什么?

对app进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于app是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。

11.能否根据app电泳后EB染色后条带的亮度对合成的app进行定量?

不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同app的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

12.2OD的app可以多少做次PCR反应?

一般来讲,20个碱基左右的2OD的app最少可以做400次PCR反应。

13.app在常温下运输,会降解吗?

不会降解,干燥的app在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的app不会降解。

14.合成的荧光标记网站应如何保存?

1) 荧光网站必须避光保存。

2)干品请于-20℃保存。

3) 强烈建议用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解网站,这样得到的网站溶液更稳定,保存时间更长。通常,将网站配制成100 pmol/ul的储备液,分装成几份 (避免反复冻融),于-20℃保存。使用前,将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul),剩余部分于-20℃保存。

15.电泳时,长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

1) A、G、C、T的组份不同,电泳速度不同;

2) DNA的立体结构不同,电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生,长链Oligo DNA之间差别较小。

16.PCR产物经克隆后测序发现,app处的碱基有错误,怎么办?

1) 因为app纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质app扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。

2) 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成app。

17.进行蛋白表达实验数个月不成功,后经测序发现app处有错误,怎么办?

1) 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。

2) 我们可以免费重新合成app。

3) 如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

18.G到A的转换。 上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。对40 怎样才能保证Oligo DNA的正确性?

1) 合成Oligo DNA时,选用高纯度级制品。

2) 避免使用过长的Oligo DNA,最好选用小于35 mer的合成DNA制品。

3) 进行克隆实验时,每次克隆都须进行测序验证,以保证序列的正确性,然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时,尤其需要注意。

19.平端的PCR产物难以克隆,为什么?

由于一般的PCR用app的5′末端都没有磷酸乐彩客,因此,扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸乐彩客。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时,无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时,背景会极高。此时请对PCR产物的5′端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。

20.进行反义核酸实验时,是否要对DNA链全部进行S代修饰,除了S代外,还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性?

DNA经S代修饰后比较稳定,在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代,的确能增加DNA的稳定性,但会降低其Tm值,也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此,科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键Phosphorothioated Bonds),这样既能增加DNA的稳定性,又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内,为增强稳定性,还是将整条链S代效果更好。

21.FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?

 它们皆是荧光素标记 (Fluorescein),5-FAM与6-FAM互为异构体;而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前者(酰胺键),但它们的发色团均为荧光素,通常使用中没有区别。

22.淬灭乐彩客为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光网站在使用上有什么不同?

 由淬灭乐彩客TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光网站常常被用作水解网站(Hydrolysis Probes),或称"TaqMan"网站,用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图),作为淬灭乐彩客使用时的特点也不同,现说明如下:

       1) TAMRA为荧光染料,在淬灭报告乐彩客的同时,自身会在更高波长处发射荧光,此发射荧光会对报告乐彩客的检测造成影响,网站荧光本底 (Background)相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料,淬灭报告乐彩客,但自身不发射荧光,因此,网站荧光本底低,信噪比更大,检测灵敏度更高。

       2) 淬灭乐彩客对报告乐彩客的淬灭有赖于二者的光谱迭盖(Overlapping),也即报告乐彩客的荧光光谱应与淬灭乐彩客的吸收光谱相交搭。对比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光谱,可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄,可与之匹配的报告乐彩客种类比较少;而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm),可淬灭的报告乐彩客种类很多,如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可;组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广,从430 nm一直到近红外,可淬灭的报告乐彩客种类更多 (象Cy3、Cy5等的淬灭效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光网站用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

23.TaqMan 网站设计时应遵循哪些原则?

1) 网站应位于两app之间;

2) 网站中碱基G、C的含量应在20%~80%之间;

3) 避免同种碱基成串出现,特别是碱基“G”;

4) 碱基G不要出现在5’末端;

5) 网站的Tm值要比app的Tm值高8~10℃,应在68~70℃之间;

6) 网站长度超过30个碱基时,最好把淬灭乐彩客放在中间,以防止荧光本底过高,这时网站的3’末端应加磷酸基封阻,以防网站在PCR反应过程中延伸。

24.何谓分子信标 (Molecular Probes)?与普通的双标记网站 (如TaqMan网站)相比,在使用上有什么特殊性?

 Molecular Probes是一类特殊的双标记网站,通常状态下,其两末端互补配对,形成茎-环结构 (发卡环结构),发卡环结构迫使分别连在两末端的报告乐彩客与淬灭乐彩客紧密邻近 (此时检测不到荧光),而一旦杂交到靶序列上,则报告乐彩客与淬灭乐彩客分开,Molecular Probes变得明亮起来,可检测到荧光。由于发卡环结构的存在,网站对靶序列检测的特异性增强,相对于普通的双标记网站 (如TaqMan网站),Molecular Probes对SNP有更强的识别能力,能区分序列上仅相差一个碱基的靶序列,因此Molecular Probes常用于SNP检测。此外,Molecular Probes也应用于活体细胞内的mRNA杂交、RNA加工、及转录过程的时时监测研究等。 

 

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