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测序问题

发布时间:2014年06月12日发布人:乐彩客生物技术关注度:1936

1.DNA测序的原理是什么?步骤如何?ABI 3730XL测序的准确程度如何?

         DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下:

         1.  定量:对乐彩客及app进行定量。

         2.  测序反应:在反应体系中加入已定量的模板和app,BigDye等试剂,PCR仪上完成测序反应。

         3.  读取数据:根据荧光的不同,读取被测乐彩客的碱基序列。

         ABI公司目前承诺测序结果在800bp以内准确率为98.5%。

2.为什么在测序报告上找不到我的app序列?

   1. 如果您提供的乐彩客是PCR产物,在测序报告上找不到您的app是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的,而测序app由于没有荧光标记,因此自然在测序结果中就不会被识别。有两种方法可以得到您的app序列。对于较短的PCR产物(<800bp),可以用另一端的app进行测序,从另一端测序可以一直测到序列的末端,就可以在序列的末端得到您的app的反向互补序列。对于较长的序列,一个测序反应测不到头,因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中,用载体上的通用app进行测序。由于载体上的通用app与您的插入序列之间还有一段距离,因此就可以得到您的完整的app序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出,因此,您如果想得到您的PCR产物的完整序列,最好克隆后进行测序。

   2. 如果您提供的乐彩客是乐彩客或菌液,PCR产物用载体克隆后,由于克隆的方向是随机的,因此,当您在一条链上找不到您的app序列时,请尝试在互补链上寻找您的app序列。

    3. 当测序app离您的插入片段很近时,有时可能也无法找到您的app的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或app二聚体的干扰,造成起始区的序列不好,可能无法找到您的app完整序列。

    4. 有时,乐彩客做模板进行测序时,由于某些原因,乐彩客上没有插入外援片段,为空载体,所测的序列完全为载体序列,此时自然也找不到app序列。

3. 我的app做PCR效果很好,为什么用于测序总得不到好的结果?

         用于测序的app比用作PCR反应的app要求高,以下是不适合用于测序反应的app类型:

         1.    不纯的app:用于测序的app纯度要求很高,合成中的小片段会直接造成严重的背景峰,因此用于测序的app序列长度一般在24个碱基之内,因为过长的app纯度不易保证。

         2.    简并app,随机app和有特殊标记的app。

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